GENOTYPING 101

2019-08-06 09:42 by 鼎博彩票生物


我们通过不同的方法对小鼠特定基因进行靶向编辑或修饰,从而获得可遗传的基因缺失(lossof function)或基因获得(gain of function)小鼠模型,并对它们的发育、形态学、生理学、病理学等各方面展开研究。开发和研究基因修饰小鼠的目的之一,就是解决后基因组时代小鼠遗传学的主要问题:为小鼠基因组中的每个基因分配一个功能。

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在我們使用基因工程小鼠模型進行課題研究的時候,離不開兩個關鍵詞。

  • Genotype(基因型)

  • Phenotype(表型)

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改變目標基因(Genotype),可能會導致小鼠某些生理過程的變化(Phenotype),從而推斷目標基因的功能。Genotype是因,Phenotype是果。

明確目標基因發生改變的過程叫Genotyping(基因型鑒定)。對于基因工程小鼠模型來說,就是區分野生型和突變型。發現並評估小鼠生理變化的過程叫Phenotyping(表型分析)。Genotyping是成就“因果關系”的基石。如果Genotyping出現差錯,那麽後續所有的Phenotyping都將謬以千裏。

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關于Genotyping,你大概需要知道以下這些事情。

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高質量的小鼠基因組DNA

随着基因編輯技術的发展,敲除或插入的基因片段越来越大、人为改造的基因结构越来越复杂,因此对小鼠基因组DNA模板的质量要求也随之提高。过去为了快速得到基因型结果,采用简单的碱变性快速抽提?DNA方法,可以应付一些短片段的PCR鉴定。但这样获得的DNA 比较“脏”,很容易发生鉴定不出结果的情况。或者使用一些直接 PCR 扩增试剂盒(例如:将鼠尾在试剂中浸泡20分钟后取上清直接作为模板),由于试剂盒选择的种类比较多,不同厂家的试剂盒扩增效率也不一样,因此也常常发生鉴定结果不理想的情况。

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综合时间成本与成功率两大因素,利用裂解液加蛋白酶K配方裂解鼠尾,释放 DNA,并通过酒精沉淀的方法得到纯度较高的DNA,是高效简便的小鼠基因组 DNA 制备方法。


鼠尾樣本基因組抽提Protocol

  • 蛋白酶K貯存液的配制:

用超纯水彻底溶解蛋白酶K粉剂, 使终浓度为10mg/ml,分装成1ml/vial, -20度保存。

  • 裂解液的主要成分:SDS、EDTA、Tris/HCl、NaCl。

  • 小鼠尾基因組DNA提取步驟:

(1)剪取小鼠尾端约0.5厘米(视鼠龄及鼠尾粗细可调整, 尽量使鼠尾体积相互接近),将鼠尾放入已编号1.5ml离心管中并盖好盖子。

(2)每管加0.5ml裂解液和50?l蛋白酶K貯存液並將蓋蓋緊。

(3)將離心管置于雜交管中並用紙團稍加固定。

(4)將離心管置雜交爐中,56℃轉動過夜。

(5)次日将样本于室温,12000rpm离心 10分钟。

(6)上清倒入1.5ml 离心管中,加1ml 无水乙醇(约2倍上清体积),盖紧盖子后轻摇,可见絮状沉淀。13000rpm, 15min,弃上清。

(7)加70%乙醇1ml,洗滌,13000rpm離心10~15min,棄上清,收集沈澱,室溫晾10~15min。

(8)每管加80~100?l 灭菌水,盖好后置室温或37℃ 1小时充分溶解。在室温中放置数小时,待DNA全部溶解后-20℃保存,或直接进行PCR或杂交等实验。如DNA溶解不完全,在37℃水浴中放置30~60min,但不可过夜。DNA样品的OD260/280在1.8-2.0之间。

  • 注意:

裂解鼠尾一定要充分,有條件盡量使用雜交爐。因爲如果裂解過程中組織與裂解液始終保持靜止,而沒有翻轉的過程,這會導致DNA和鼠毛之類的雜質沒有完全分開。離心去除雜質的過程中,DNA就會隨著這些雜質一起被抛棄了。

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常用的Genotyping方法


聚合酶鏈式反應(PCR)+凝膠電泳

基因工程小鼠基因型PCR 鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异,以小鼠基因组DNA为模板进行PCR,并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小(一般差异在100bp以上),根据电泳条带差异来直接区分小鼠的不同基因型。

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適用于:

Knockout(包括CRISPR介導片段敲除)

Conditional knockout

Knock-in(片段敲入)

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常規PCR電泳結果示意圖:

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PCR+酶切或測序

如果目標基因突變的堿基數很少,很難通過PCR産物大小來直接區分,那麽有以下幾種方法來鑒定基因型。

1) 对于多个碱基连续突变的情况,可以采用三引物的方法,一条为共用引物,另外两条为差异引物。这两条差异引物的3’端设计在发生突变的区域,利用针对野生型引物只能扩增出野生型条带,针对突变型引物只能扩增出突变型条带的原理,区分野生型、杂合子和纯合子基因型。这种方法受引物设计位点的限制、同时对PCR条件的要求很高,较易出现假阳性情况,因此不太实用。

2)可以利用突變前後酶切位點的改變,通過對比酶切産物來區分基因型。該方法僅限突變産生了新的酶切位點或導致原有的酶切結果條帶大小發生明顯變化。操作起來比較繁瑣,同樣也有假陽性、假陰性的情況。

3)可以采用TA克隆和测序的方法,通过测序峰型图来判断(如下图所示)。几乎适用于所有點突變情况,而且结果可靠性高,是性价比非常高的鉴定方法。

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適用于:?

Knockout?(CRISPR介導NHEJ産生Indel)

Point?mutation(CRISPR介導HDR)

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Knockout小鼠模型測序結果示意圖(CRISPR介導NHEJ産生Indel):

如下图所示,图A为野生型小鼠PCR 产物测序峰图。图B为阳性F0 代小鼠基因型鉴定PCR 产物测序峰图。CRISPR/Cas9 作用后,由于发生NHEJ随机修复,产生多种基因型,在Cas9 切点附近出现杂峰。图C为阳性F1 代小鼠基因型鉴定PCR 产物测序峰图。阳性F1 小鼠基因组一个拷贝是野生型,一个拷贝是突变体,在Cas9 作用位点附近区域测序有后双峰现象(两种基因型产生了两种峰型)。图C’ 和图C”是图C中测序PCR 产物连接T-vector 后,单克隆测序结果。其中,图C’ 为野生型,图C” 为突变体。峰型对比可以发现C” 较C’ 缺失了两个碱基CC。C’ 和C” 峰型结果可以和C 图峰型结果向吻合。

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Point?mutation小鼠模型測序結果示意圖(CRISPR介導HDR):

如下图所示,图A为野生型小鼠PCR 产物测序峰图。图B为阳性F0 代小鼠基因型鉴定PCR 产物测序峰图。CRISPR/Cas9 作用后,由于发生同源重组修复(HR) 的同时,也可能发生非同源重组修复(NHEJ)。因此,切点附件可能出现杂峰。图C为阳性F1 代小鼠基因型鉴定PCR产物测序峰图。阳性F1 小鼠基因组一个拷贝是野生型,一个拷贝是突变体,在Cas9 作用位点附近区域测序,突变点位置有双峰现象(野生型和突变体,两种基因型产生了两种峰型)。图C’ 和图C” 为图C中测序PCR 产物链接T-vector 后,单克隆测序结果。其中,C’为野生型,C” 为突变体。峰型对比可以发现C” 较C’ 的目的突变点CCT 突变为GTT,C’ 和C” 峰型结果可以和C 图峰型结果相吻合。

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常用Genotyping引物設計方案


Knockout小鼠模型(片段敲除)

双引物(一对)方案:分别在敲除片段的上下游各设计一条引物。下图B为小鼠ES細胞打靶途径的引物策略与PCR产物大小示意图。下图C为CRISPR途径的引物策略与PCR产物大小示意图。


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Conditional knockout小鼠模型

双引物(一对)方案:可以分别在flox区域上下游各设计一条引物。下图为小鼠ES細胞打靶途径的引物策略与PCR产物大小示意图。图A可鉴定flox小鼠中Neo基因是否被去除;图B则示意了在特定组织中flox区域是否被敲除。CRISPR途径构建的CKO小鼠模型的引物设计策略也可参考下图,去除frt-Neo-frt结构。


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Knock-in小鼠模型(片段敲入)

四引物(两对)方案:小鼠ES細胞打靶途径或CRISPR途径构建的KI小鼠模型,都可以参照以下策略来设计鉴定引物。第一对引物分别设置在敲入位点上下游;第二对引物中的一条设计在敲入序列上,另一条设计在同源臂上。且两对引物的PCR产物大小具有明显差异。

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Point?mutation小鼠模型(CRISPR途徑)

双引物(一对)方案:针对包含點突變位置上下游共约300-800bp的区域设计PCR引物。获得的PCR产物通过酶切或测序的方法判断基因型。

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成功PCR的小技巧

由于每個實驗室、每台PCR儀的實際條件不同,因此即使是被驗證過的PCR體系,在不同的實驗室中可能也會有不成功的情況。

以下幾點Tips也許可以幫你:

  • 設計特異性高的引物。設計引物時,要進行BLAST比對,從而盡量排除非特異性PCR産物出現的可能。

  • 找到最适宜的退火温度。一般可以通过梯度PCR的方法,对退火条件进行摸索。退火温度梯度可以设为引物对Tm值上下5?℃。Tm计算公式为:Tm = 4℃(G+C)+ 2℃(A+T)。如果没有扩增到预期的条带,可以降低退火温度帮助引物更有效地结合。如果非特异性条带很多,则可以提高退火温度来消除非特异性引物结合。

  • 多引物對的PCR不成功時,需要分開優化。如果PCR體系中存在多對引物同時反應,而最終未能擴增到PCR産物,那麽要對每個引物對進行單獨的PCR反應,從而調整優化整個體系。

  • DNA过多或过少都会导致PCR不成功。一般模板浓度控制在50-100ng/?l 比较合适。

  • 使用合适的PCR 酶。不同的 PCR 产物 GC 含量不一样,遇见 GC 含量很高的产物往往常规的 PCR 酶没法做出很好的结果。一般在定制的基因工程小鼠鉴定方案中会指出适合的 PCR 酶的货号,按照已验证的方案以及推荐的酶体系,一般不会出错。

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對照的重要性

在一般的?Genotyping 里面,每一次鉴定都至少要设置一个 WT Control 和一个 H2O,也就是 Blank Control。

WT Control

1)帮助我们快速判断基因型。在 Flox 小鼠或片段 knockin 小鼠的鉴定中,如果产物条带仅有一条或其中有一条与 WT Control 一致,那么可以判断该样本为 WT 或 杂合子。

2)帮助我们判断 PCR 体系是否 work。如果 PCR 产物在跑电泳的时候连WT Control 的样品都没有出条带,那么说明 PCR 体系有问题,需要做相应的调整,比如考虑更换引物或 PCR mix 等。

Blank Control

H2O 对照主要是用来质控 PCR 体系是否发生了污染。如果 H2O 对照都有条带,说明整个 PCR 体系存在污染的问题,这个 PCR 结果不可信。

Internal Positive Control

Internal Positive Control内部对照引物通常扩增与目的基因无关的基因组DNA区域。一般用在随机插入轉基因小鼠的鉴定中。通常轉基因鉴定引物是只针对插入的外源 DNA 序列的,所以没有发生随机整合的小鼠 DNA 模板不会有 PCR 产物产生。这样一来很容易发生假阴性的问题。也就是说电泳没有条带,我们无法判断到底是外源基因未整合的阴性结果,还是由于 PCR 体系本身的问题造成阴性结果。所以需要另一对在所有小鼠中都能获得 PCR 产物的阳性对照引物作为内控,即Internal Positive Control,用于判定 PCR 体系和模板质量是否合适。


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如何消滅PCR汙染

  • 鼠尾取樣時,每一次剪鼠尾之前,都必須要用75%酒精擦拭清潔剪刀。或准備兩把剪刀輪流使用,用完的剪刀浸泡在75%酒精溶液中。

  • 推薦用裂解液和蛋白酶K處理鼠尾後將DNA純化之後做PCR鑒定,這樣可以降低汙染的概率。

  • 在PCR实验前用75% 乙醇擦拭工作台、移液枪表面、手套。

  • PCR試劑的分裝。最好提前將去離子水、大包裝的緩沖液等PCR試劑分裝在1.5ml或1ml離心管中。避免原裝瓶反複使用引起的汙染。

  • 配置?PCR 反应体系的过程中枪头要及时更换。尽量使用带有滤芯的枪头。

  • 加試劑時手握PCR管的中下部,盡量遠離PCR管口,避免交叉汙染。

  • 用完的試劑管要及時蓋上蓋子。

  • 配置完成後要仔細蓋緊PCR管蓋。特別是使用像8聯管這類PCR管,要檢查蓋子是否蓋緊,以免導致在PCR機器裏時水分蒸發。另外,配置後要輕輕混勻PCR體系並短暫離心,以免試劑黏在試管壁上導致反應不充分。

  • 配制?PCR 反应体系的实验台尽量和 PCR 仪以及电泳槽分开,因为 PCR 仪和电泳槽附近的区域往往是高浓度 DNA 弥散的区域。

  • 跑电泳过程中,上样的枪头最好及时更换。如果没有更换,那么每次上完一个样都要在电泳?buffer 中吹打清洗干净。防止枪头上带有前一个样品的产物,造成点样的污染。

  • 利用qPCR排除假阳性。在鉴定?Cre 和 Flp 这些轉基因小鼠的时候,可以尝试通过荧光定量 PCR 做相对定量的方法来避免假阳性的问题。具体是指在荧光定量PCR的时候,同时鉴定目的基因和内参基因,通过△Ct的方法来确定阳性产物,可以有效避免因为少量污染造成的假阳性问题。

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