鼎博彩票生物斑馬魚平台助力HSP发病机理研究

2019-07-31 14:57 by 鼎博彩票生物


遺傳性痙攣性截癱(HSP)又稱家族性痙攣性截癱,是一種神經系統退行性變性疾病。其病理改變主要是脊髓中雙側皮質脊髓束的軸索變性或脫髓鞘,以胸段最重。臨床表現爲雙下肢肌張力增高,腱反射活躍亢進,病理反射陽性,呈剪刀步態。2018年5月11日,中國國家衛生健康委員會等5部門聯合制定了《第一批罕見病目錄》,遺傳性痙攣性截癱(HSP)被收錄其中。


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2019年6月15日,鼎博彩票生物斑馬魚平台與福建醫科大學附屬第一醫院神經內科陳萬金與王檸教授團隊合作在全球臨床神經學頂級雜志《Brain》在線發表了題爲“Stop-gain mutations in UBAP1 cause pure autosomal-dominant spastic paraplegia“的研究长文(Original Article)。

該研究不僅豐富了HSP致病基因譜,爲基因診斷奠定了基礎;而且所發現的致病基因UBAP1編碼蛋白參與內體轉運裝置複合物I(ESCRT-I)的組成,其介導的核內體相關轉運障礙可導致多種神經退行性疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病等),因此也爲該類疾病的發病機制提供了新的線索。

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圖1.?4個常染體顯性的HSP家系中,發現了UBAP1基因的無義突變。



通过靶向测序作者首先在112个HSP家庭中,发现了74个家庭中含有能够引起HSP的常见79个基因突变。为了更系统的寻找一些未知突变基因,作者通过家系四个病人(图1A)的全外显子测序并通过一定的标准筛选到5个能引起HSP的杂合突变基因:UBAP1 (c.247_248insGTGAATTC), ARMC12 (c.274C4T), CRISP2 (c.320G4C), ZNF735 (c.1010C4T), and DNAH1 (c.2391+5g4a)。通过对(图1B-D)HSP病人的全外显子测序,发现只有UBAP1基因的突变同时出现在四个家系中, 并且都导致了UBAP1蛋白翻译的提前终止。接着作者做了4个家系UBAP1基因位点的全测序,并进行了共分离分析。以上这些数据有力的证明了UBAP1基因4個位點的無義突變可能引起了常染色體顯性遺傳痙攣截癱(HSP)。

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由于UBAP1基因在人,斑馬魚和小鼠中是保守的,因此作者希望通过斑馬魚和小鼠模式生物进一步研究UBAP1基因在HSP发病过程中的生理功能。


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图2. ?hb9:GFP斑馬魚中ubap1基因生理功能的鉴定。

作者首先在鼎博彩票生物构建了ubap1基因的MO斑馬魚模型,I2E3-MO和ATG-MO。ubap1基因knockdown后,斑馬魚的形态异常,幼体运动能力减弱以及寿命缩短。这些表型和SPAST,?PNPLA6,?GBA1等基因突变后引起的HSP表型是一致的。因此,作者推测ubap1基因的突变和遗传性痉挛截瘫有着直接的关系。

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图3. 截断的UBAP1蛋白影响核内体的形成和泛素化蛋白的合成但不改变和ESCRT-1复合物的结合。

作者接下来探究分子机制。以前的研究表明,UBAP1可以通过UMA 功能域和ESCRT-1复合物结合。作者通过CO-IP(蛋白质免疫共沉淀),发现截断的UBAP1仍然可以和ESCRT-1复合物结合,且结合能力没有降低。根据以前的文献报道,作者在HeLa细胞中过表达了UBAP1的完整形式和截断形式,结果发现在过表达截断蛋白的细胞中核内体形态异常,泛素化相关蛋白增加。因此,作者得出結論,UBAP1可能對于核內體的形成以及泛素相關蛋白的合成有著重要的作用。



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图4. 小鼠皮层神经元Ubap1基因的敲除引起核内体的增大和泛素化相关蛋白的聚集从而促进神经元的凋亡。

接著,作者構建了Ubap1的條件性敲除小鼠驗證Ubap1基因的生理功能。通過和Cre小鼠交配,作者在皮層神經元內發現了初始核內體的聚集以及泛素化相關蛋白胞漿內的高表達,這和在Hela細胞中觀察到的結果是一致的。並且作者發現,在Ubap1敲除的神經元軸突區域,發現了神經元凋亡的病理特征。緊接著作者在Ubap1敲除的皮層神經元中檢測了標識凋亡信號的相關蛋白,結果發現在Ubap1敲除的皮層神經元中凋亡比率大大增加。



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图5. 完整形式的UBAP1可以rescue皮层神经元由于缺失Ubap1而造成的表型。

最后作者通过rescue实验验证UBAP1蛋白的结构功能域。结果表明,只有UBAP1的完整形式能够rescue 皮层神经元Uabp1基因缺失造成的表型,缺少HDP-PTP结合域或者SOUBA功能域的截断形式不能rescue 皮层神经元Uabp1基因缺失造成的表型。这些结果表明在哺乳动物神经元中,UBAP1的HDP-PTP结合域和SOUBA的功能域在调控核内体的形成和泛素化相关蛋白的合成方面起着重要的作用。


综上,文中单位作者通过斑馬魚和小鼠等模式生物证明了UBAP1单基因功能缺失可导致运动神经元发育异常,进而导致人类遗传性痉挛性截瘫(HSP)。



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